近期，许多同学向小尚反馈细胞复苏效果不佳。细胞复苏是细胞培养中的常规操作，但其中有许多细节常常被忽视。复苏的成败与冻存及复苏操作密切相关，稍有不慎可能导致损失不可挽回。本文将重点从冻存的角度进行分析，下周将提供针对复苏操作原因的排查分析，欢迎同学们收藏并关注更新。

冻存步骤回顾

让我们先复习一下冻存的基本步骤：
1. 提前准备好冻存液备用；
2. 离心获得细胞沉淀后，加入冻存液轻轻重悬细胞；
3. 将细胞悬液转移至冻存管；
4. 如果使用程序冻存液，将冻存管放入程序冻存盒中，放入-80℃冰箱过夜，再转入液氮保存；如果使用非程序冻存液，则无需冻存盒。

冻存常见错误操作

尊龙凯时提醒您注意以下常见错误：

1. 使用常规含血清冻存液（培养基+血清+DMSO）时，没有使用程序降温的冻存盒或泡沫盒等保温措施。降温过快会形成冰晶，导致细胞破裂死亡。常规冻存液必须配合冻存盒使用。市售程序冻存盒可以确保温度以1℃/min的速度慢慢降低。如果没有冻存盒，可以将冻存管放在泡沫盒中，4℃静置5-10分钟，再转入-20℃静置2小时，最后置于-80℃冰箱过夜，第二天转入液氮保存。对于没有冻存盒和泡沫盒的同学，建议使用无血清的非程序冻存液，其保护剂含量更高，可以直接重悬细胞后置于-80℃冰箱过夜，之后再转入液氮。

2. 冻存前细胞状况不佳或冻存密度太低。细胞良好的状态是复苏成功的前提，建议选择对数生长期、汇合度在80%以上的细胞进行冻存。如果冻存前的细胞培养上清呈橘黄色，建议换液后静置培养4小时再进行冻存。尽管冻存液含有保护剂，冷冻过程中仍会有少量细胞死亡。因此，冻存的密度不可过低，建议为200-300万/mL/管。如果不方便计数，可以按照一个T25瓶冻存1-2管，一个10cm皿冻存2-3管的方式（确保细胞汇合度在80%以上）。

3. 直接将DMSO加入细胞悬液，未提前配制冻存液。DMSO被稀释时会释放热量，可能对较脆弱的细胞造成损伤。尽管有些细胞对这种操作的影响不大，但为了确保实验顺利，建议提前配制好冻存液，再处理细胞。

4. 细胞在重悬后直接放入液氮，而未经过-80℃冰箱。液氮的温度为-196℃，未经梯度降温直接放入液氮的细胞必然会死亡。请务必经过-80℃冰箱逐步降温。

5. 冻存液的配方不适宜。研究表明，5%-10%的DMSO最适合细胞冻存，具体比例需根据细胞种类调整。对于DMSO敏感的细胞，需要降低比例。根据尊龙凯时的经验，8%DMSO适合大多数细胞系。另外，需根据细胞培养难度调整血清比例，难养的细胞更需添加更多血清。对于特别脆弱的细胞，可使用血清+DMSO冻存，但不加培养基。不论使用何种冻存液，都建议先进行冻检：即冻存24小时后复苏一支，以确认细胞状态良好后再进行大批量冻存。冻检成功前，最好保存至少一瓶细胞，以防复苏失败导致细胞绝种。

6. 不当的冻存条件或过长时间的冻存。通常，液氮的储存稳定性比-80℃冰箱要好得多。-80℃冰箱由于频繁开关门，温度不够稳定，导致细胞活率下降较快，因此尽量选择液氮保存。若没有液氮罐，建议将冻存管放在-80℃冰箱的内部位置，并定期复苏检测活性。

未完待续…